Para analizar sus diversas aplicaciones es importante realizar la diferenciación de su uso cuando no van asociadas a ninguna proteína cuya única función es la de colorante y cuando si van ligadas a otra secuencia de aminoácidos permitiendo observar la función de la proteína a la que se ha unido. También podemos clasificarlas dependiendo de si se introducen con el fin de observar contínuamente un proceso o se modifican de tal manera que muestran su fluorescencia dependiendo de las condiciones en las que se encuentre.

Estas proteínas resultan muy eficaces como marcadores puesto que al no tratarse de enzimas no afectal al comportamiento fisiológico de las células permitiendo observar procesos que resultaban invisibles sin alterarlos.

PROTEÍNAS FLUORESCENTES PARA EL ESTUDIO DEL CÁNCER.


Una de sus aplicaciones de importancia es el uso de la proteína GFP en ratones modificados a los cuales se les introduce una célula cancerosa permitiendo, cuando son iluminados con luz azul, mostrar esas células posibilitando el seguimiento de éstas controlando las zonas de metástasis. También permite estudiar los efectos de diferentes fármacos en las células infectadas.

La función de MT1-MMP es clave para el desarrollo de metástasis en cáncer y la utilización de GFP nos ha permitido desenmascarar el mecanismo molecular responsable de la función pro-invasiva de esta molécula lo cuál se puede observar en el vídeo:




DETECCIÓN DE ESTRÉS


Otra de las aplicaciones es la detección del estrés. Un grupo de científicos está estudiando la cantidad de estrés que tiene un individuo para poder relacionarla con la enfermedad crónica que éste puede desarrollar en un futuro. Este estudio se centra principalmente en dos moléculas llamadas "Cerulean" y "Venus" que cuando se produce el estrés aumentan su longitud. Además, cuando hay estrés también varía el radio de emisión de luz de dichas moléculas.


ÓRGANOS INTERNOS VISIBLES EN MAMÍFEROS GRACIAS A UNA NUEVA PROTEÍNA FLUORESCENTE.


Los investigadores del Colegio de Medicina Albert Einstein de la Universidad Yeshiva de Nueva York han desarrollado una nueva proteína fluorescente que permite ver órganos de animales vivos sin ser expuestos a radiación u otra técnica similar con efectos negativos en su salud. El uso de proteínas fluorescentes en mamíferos ha sido un gran reto ya que la hemoglobina de la sangre absorbe longitudes de onda azul, verde, roja y alguna otra dificultando así su utilización. Para resolver este problema, se ha desarrollado una nueva proteína fluorescente de un fitocromo (pigmento usado para detectar luz) de una bacteria que absorbe y emite luz a otra longitud de onda distinta. El experimento que realizaron trataba de poder visualizar las células del hígado, un órgano complicado de ver debido a su gran contenido en sangre. Para ello, introdujeron en ratones un adenovirus que contenía el gen de esa proteína fluorescente. Las células infectadas expresaban el gen. Cuando los ratones eran expuestos a luz infrarroja, se observaba la fluorescencia emitida. Con esta técnica se puede estudiar, por ejemplo, el crecimiento de tumores sin utilizar radiación u otros procedimientos perjudiciales.



UN EXPERIMENTO ESPECTACULAR: EL ARCO IRIS CEREBRAL.

Estas proteínas fluorescentes se utilizan en diversos campos. Un grupo de científicos de la Universidad de Harvard realizó un experimento con dichas proteínas. Introdujeron los genes que codificaban para proteínas de varios colores fluorescentes distintos en embriones de ratón, obteniéndose de esta forma unos 90 colores distintos debido a los procesos de recombinación y a las copias de las proteínas introducidas. El resultado fue asombroso. Con ello se consiguió visualizar todo el tejido nervioso. Hasta el momento, tanto la uniformidad del tejido neuronal como el color y calidad de las imágenes dificultaban la tarea de visualizarlo y estudiarlo pero gracias a esta técnica llamada "brainbow" se ha podido distinguir células individuales, las conexiones entre ellas y el recorrido de muchas neuronas.

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Células del tejido nervioso marcadas con GFP















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Proteínas fluorescentes de distintos colores



TRANSFERENCIA DEL VIRUS VIH DE UNA CÉLULA A OTRA.


En el vídeo se puede observar cómo una célula infectada por el virus VIH transfiere algunas partículas víricas a la célula vecina mediante contacto sináptico entre ambas. El material genético del virus ha sido modificado para integrar el gen que expresa la proteína verde fluorescente (GFP), haciendo visible de este modo el proceso de transmisión de la infección. Para observar el experimento, se ha empleado un microscopio de fluorescencia que posee una lámpara de emisión de luz ultravioleta y un conjunto de filtros que amplían la señal de fluorescencia recibida.



UNA LUZ VERDE PARA LA BIOLOGÍA-HACIENDO VISIBLE LO INVISIBLE.




APLICACIÓN EN LA GENÉTICA.


Las proteínas son introducidas en diferentes genes para ser localizados y estudiar su transmisión a los descendientes permitiendo analizar completamente su expresión. Mediante estos estudios se puede comprobar si se han realizado con éxito las modificaciones en animales transgénicos. Un caso conocido es el estudio de la respuesta inmunitaria en embriones del pez cebra, donde las proteínas fluorescentes son introducidas en los neutrófilos.

Hoy por hoy es una técnica muy utilizada entre los científicos, a parte de las aplicaciones mencionadas anteriormente,también se han podido visualizar, gracias a las GFP, el desarrollo de las células nerviosas, valorar la eficacia de la intersección de otros genes, cómo los vasos sanguíneos le dan cierto soporte a los tumores.

El daño neuronal que sufren los pacientes con Alzheimer o la creación de células productoras de insulina son otros de los campos destacados por la Fundación Nobel y en los que la fluorescencia ha resultado esencial.


APLICACIÓN EN PLANTAS


Hoy en día se utiliza en todos los campos de la investigación sobre todo en biología celular. Además, gracias a la multitud de colores que ha conseguido Roger Tsien también se puede emplear en el estudio de plantas, ya que antes el verde fluorescente no permitía su uso en ellas.

Antes de su descubrimiento la única manera de observar las estructuras celulares eran tiñéndolas externamente, eran células fijadas (muertas) y manipuladas, pero ahora con la GFP se pueden hacer estudios de microscopía en células vivas, intactas y en procesos dinámicos. Hace años, la visualización era como una foto 'fija' de las estructuras y ahora se podría decir que esta proteína permite ver el 'vídeo' en tiempo real de los procesos biológicos.

En este vídeo podemos observar cómo se mueven los neutrófilos en vivo durante una respuesta inmunológica al provocar un corte en la cola del embrión de pez cebra.




Estas proteínas también son utilizadas en el estudio de células "in vivo" en modelos animales con enfermedades neurodegenerativas como el alzheimer o la enfermedad de Huntington.


LA APLICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS FLUORESCENTES EN LA FLUORESCENCIA MICROSCÓPICA


La aplicación más desarrollada es la de sensor bioquímico que muestra la transferencia de energía entre dos proteínas. Esta capacidad es denominada tranferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) .

Su funcionamiento se basa en la superposición del espectro de emisión de uno de los fluoróforos, el donador, con otro próximo, el receptor. Por este motivo, la excitación del primero produce la fluorescencia, al disminuir la suya, del segundo, la cual aumenta, al transmitirle energía.

Los primeros pares de proteínas han sido las GFP y las BFP, estas últimas de poca duración, actualmente las más eficaces son las mutantes CFP y YFP. Resultan muy eficaces debido a su relación espacio – tiempo en el estudio de interacciones proteína – proteína sin embargo presentan la desventaja de la necesidad de la correcta colocación de los fluoróforos.

Existen diferentes técnicas relacionadas estrechamente con la FRET como la FLIM que permite conocer la vida media de fluorescencia de un cromóforo. Otras técnicas son las de fotoblanqueado, destrucción de la fluorescencia de un cromóforo. Las más comunes son FRAP, FLIP e iFRAP. La FRAP permite la recuperación de la fluorescencia después del blanqueamiento y con un microoscopio se observa esa recuperación paulatinamente. Dependiendo de lo que se quiera observar se realiza un análisis cuantitativo, si la proteína esta unida a un gran complejo proteico, o cualitativo, para determinar el coeficiente de difusión de la proteína. La técnica FLIP es similar a la FRAP pero esta permite el seguimiento de la ruta del fluoróforo blanqueado. Se utiliza para examinar el movimiento de moléculas en células o membranas. La iFRAP es el proceso inverso de la FRAP (el blanqueamiento de toda la célula excepto de la zona de interés).

PROTEINAS FLUORESCENTES EN TRANSPLANTES


Su función principal es la de poder cuantificar el grado de implantación, la colonización de las células exógenas y los subtipos que desarrollan.

Los ratones transgénicos que expresan la proteína EGFP en todo momento y en cualquier tipo de célula se han convertido en los elegidos para realizar los experimentos de preparación de trasplante celular. El seguimiento de las células exógenas es sencillo gracias a la fluorescencia de las GFP.

ENFERMEDAD DE HUNTINGTON.

La GFP fusionada a otra proteína permite obtener la información de los tipos celulares que la expresan como la localización subcelular de la proteína objeto. Esto resulta útil en modelos animales con proteínas patogénicas como es el caso de la enfermedad de Huntington. La causa de esta enfermedad es la mutación en una secuencia larga en la proteína huntingtina que hace que esta se autoagregue. La inserción de GFP en la secuencia mutada permite observar el nivel de expresión de la proteína patogénica en los diferentes tejidos a lo largo de la vida del animal además de la formación y localización subcelular de los agregados proteicos aberrantes.

También se utilizan como biosensores pues se considera que la acumulación de los proteicos aberrantes tenga lugar debido a un mal funcionamiento del sistema ubiquitina proteasoma. Se han generado nuevas formas de GFP que son rápidamente degradadas por el proteasoma. Cuando los genes que codifican estas formas de GFP se expresan en una célula la proteína no se llega a acumular y por tanto no muestra fluorescencia a no ser que el sistema ubiquitina proteasoma no funcione correctamente.