FOTOENCRUZADORES GENÉTICAMENTE CODIFICADOS PARA EL ESTUDIO DE GPCRs.
Estructuras cristalinas de diversos receptores y complejos de receptor / ligando constituyen un paso importante para el estudio de las características dinámicas de estos sistemas. Sin embargo, los receptores son generalmente proteínas integrales de membrana, y por lo tanto suelen ser difíciles de cristalizar. Además, en la mayoría de los casos las estructuras suelen captar sólo una instantánea de un estado fundamental unido al ligando y en consecuencia se limitan a una sola imagen estática de un estado particular de conformación. Numerosos ligandos hidrofílicos incluyendo las feromonas, hormonas, neurotransmisores, moléculas pequeñas, péptidos, e incluso proteínas grandes median las señales desde el medio ambiente al medio intracelular a través de receptores, jugando por ello esta clase de proteínas un papel importante en la comunicación intercelular. Por lo tanto se requerían urgentemente estudios biofísicos, bioquímicos, espectroscópicos, y funcionales para poder obtener una visión más clara de la especificidad, afinidad, reconocimiento y unión de los ligando, así como de la conformación dinámica de los receptor-ligando.

Como ya hemos comentado, los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) son ejemplos clásicos de proteínas de membrana implicadas en la activación y regulación de vías de señalización celular. Estas GPCRs se en distintas clases denominadas A, B, C, o Grafs según los representantes más importantes (el glutamato, la rodopsina, la adhesión, las familias frizzled, y las familias de secretina). Actualmente el 30% de todos los medicamentos aprobados tienen como destino las GPCRs, por ello es necesaria información química sobre el mecanismo molecular de señalización transmembrana y para la comprensión molecular de este proceso, ya que es de gran interés farmacéutico.
La incorporación de aminoácidos no canónicos (NCAA) en proteínas se ha convertido en una herramienta importante para estudiar las propiedades bioquímicas de las proteínas de una manera sofisticada y que se puede utilizar para compensar la falta de información estructural de estas. La ventaja de la incorporación dirigida al sitio de NCAA es la posibilidad de introducir cadenas laterales de aminoácidos reactivos específicos. Éstos se pueden utilizar para estudiar las limitaciones estructurales específicas por derivatización, por ejemplo el etiquetado mediante fluorescencia o con biotina, o por sitio específico de entrecruzamiento mediante compañeros de interacción.

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Se han desarrollado diferentes técnicas para introducir NCAA, incluyendo la ligadura química nativa y la expansión del código genético mediante el uso de las tecnologías de supresor basadas bacterias auxótrofas. NCAA fotolábiles, tales como p-benzoil-L-fenilalanina (Bpa), que se unen covalentemente a cadenas laterales interactuando y asociándose a una distancia de entre 3 y 4 Å son especialmente útiles tras la irradiación. Estos métodos químicos in situ no invasivos, son sin embargo, sólo posibles si la maquinaria de traslación reprogramada está disponible en las células estudiadas. Además, la incorporación de cetoaminoácidos tales como p-acetil-L-fenilalanina (ACF) permiten el etiquetado específico con derivados de hidrazina o hidroxilamina.

Debido a la baja abundancia de GPCR en las células, y las dificultades para su expresión recombinante bacteriana y su solubilización, algunos ejemplos que se han notificado hasta ahora que expresen eficientemente los GPCR son aquellos que contienen NCAA. En 2008, Sakmar y sus compañeros de trabajo incorporaron dos NCAA distintos (AcF y Bpa) en dos GPCRs diferentes: CCR5 (un receptor de quimioquinas y un co-receptor para el virus de la inmunodeficiencia humana) y la rodopsina. Tanto el AcF como el Bpa, se introdujeron en los GPCR de células HEK293T de mamíferos, utilizando para ello dos pares ortogonales (o pares) que consisten en tRNA supresor de Bacillus stearothermophillus (BST-Yam) y se desarrolló Escherichia coli tyroysl tRNA-sintetasa (TyrRS) variantes de ACEFR y BpaRS. Estas juntas pares fueron desarrolladas anteriormente para la traducción de NCAA en la lectura a través de un codón de terminación ámbar (UAG) en ARNm de la levadura. LosGPCR, que albergaban grupos reactivos ceto en posiciones específicas generaron cantidades suficientes tales que una variedad de sondas podía ser introducida (por ejemplo, la rodopsina puede ser no invasiva marcado por fluoresceína hidrazida). Del mismo modo, Becker y sus compañeros de trabajo utilizaron Bpa para investigar el posible sitio de unión del receptor de feromonas Ste2 (a GPCR levadura). Ellos fueron capaces de identificar enlaces cruzados positivos como posibles sitios de unión para su péptido natural el factor de ligando α. Mientras tanto, AZF fue también incorporado con éxito en la rodopsina para medir la dinámica transformada de Fourier (FTIR).

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Estos primeros experimentos confirmaron que el sitio específico de inserción de NCAA en el receptor es una herramienta invaluable no invasiva para estudiar los mecanismos y la dinámica de la unión del ligando GPCR y la transmisión de la señal. Es de particular importancia que el repertorio de NCAA nos permita obtener información sobre la estructura y la función de las GPCR mediante, por ejemplo, el atrapado de un complejo receptor-ligando mediante agentes de reticulación fotoactivables, o mediante el control de su movilidad con sondas fluorescentes. Además, el etiquetado de un receptor usando pares “o” podría ser combinado con el uso de diversos ligandos sintéticos. Sakmar y sus colaboradores emplearon un enfoque de fotorreticulación in situ mediante el uso de pares de AZF y ACF para estudiar las interacciones de unión del inhibidor T140 específico para el receptor de quimiocinas CXC 4 (CXCR4). Este receptor es importante en lo referente a la migración celular dirigida, metástasis del cáncer, y la entrada del VIH. Se probaron ocho posiciones de aminoácidos en la interfaz de este receptor y se le asignó un único UV de reticulación dependiente de la luz en vivo, el sitio de interacción específica entre el CXCR4 residuo 189 y el T140 (VIH-1 co-bloqueante del receptor). Es importante destacar que los resultados fueron consistentes con la estructura cristalina basada en el modelo molecular con inhibidores peptídicos.
El primer estudio de una GPCR de clase B fue estudiada por Wang y sus colaboradores, quienes estudiaron el factor de liberación del receptor 1 de corticotropina (CRF-R1), cuya unión endógena del péptido al ligando participa en la respuesta al estrés. Como otros miembros de la clase B de GPCR (o familia de la secretina), CRF-R1 tiene un gran dominio N-terminal (aproximadamente 120 residuos) que es utilizado como el principal sitio de unión del péptido a bases de ligandos. Puesto que ningún receptor de longitud completa ha sido caracterizado estructuralmente por espectroscopía de RMN o cristalografía de rayos X, la información estructural de estos receptores es principalmente relacionada con estudios de actividad-estructura y con estudios clásicos de reticulación (por ejemplo, la derivatización de cisteínas con tiol específico de maleimida o basado en reactivos de haloacetamida). En este estudio, los receptores CRF-R1 se investigaron en células 293T transfecridas con el plásmido que codifica el o-par (tRNACUA (Tyr)-AzFRS derivada de E. coli) para la incorporación específica en el sitio AZF en respuesta al codón UAG. En la configuración experimental, el ligando endógeno fue marcado radiactivamente. Esto hizo posible identificar puntos de reticulación que generalmente, no se encuentran en las investigaciones de entrecruzamiento tradicionales. Se han localizado más finamente y se ha observado la activación de estas interacciones aún más por el estudio del comportamiento de entrecruzamiento de diferentes ligandos en el mismo conjunto AZF que contiene varios receptores fijados. Cuatro AZF diferentes que contienen variantes de CRF-R1 se probaron para el entrecruzamiento en paralelo con los cuatro ligandos radiomarcados. Curiosamente, el número de sitios de entracruzamiento era sorprendentemente pequeño, lo que indica que los ligandos no están estrechamente unidos a los receptores en el contexto nativo celular de los complejos CRF-R1.

Con estos experimentos y últimos descubrimientos, la tecnología del código genético expandido demostró tener un uso indispensable, no invasivo en estudios in vivo en células de mamíferos e incluso en organismos completos, ya que ofrece sondas químicas para manejar el seguimiento de las interacciones receptor-ligando, la activación del receptor, y el tiempo real de activos complejos de señalización. Sin embargo, la aplicación sistemática de esta metodología todavía se enfrenta a varios retos. Ejemplos son la correcta transcripción de los tRNAs de pares “O”, y el posterior tratamiento, modificación, y exportación al citoplasma de la célula, con el requisito de que una o-aaRS sea altamente específica tanto para el ARNt ortogonal como el thencAA. Finalmente, el ARNm que codifica el gen de interés y teniendo del codón de stop localizado podría convertirse en un sustrato para la degradación, mediada por el antisentido (NMD), que podría destruir transcripciones con señales de terminación prematuros. Los resultados obtenidos por el uso de p-azido-L-fenilalanina (AZF) en el contexto biológico deberán evaluarse críticamente, ya que a partir de su incorporación a la proteína diana se observan también las formas reducidas. Esto podría contribuir a la reactividad química y la fotoinestabilidad del grupo aryl-azido durante diferentes procedimientos analíticos tales como los análisis de masas. Sin embargo, se ha descrito que, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae se puede utilizar como biocatalizador para reducir arylazides a arilaminas.

Junto al problema de la estabilidad química y metabólica, así como el de la captación intracelular de NCAA particulares, hay al menos cuatro aspectos que deben ser tomados en consideración antes de planificar y diseñar estos experimentos:
  • En primer lugar, mientras que la eficacia de incorporación de NCAA es relativamente alta en E. coli, en general es mucho más baja en la levadura y especialmente en células de mamífero. Es decir, bajo la lectura a través de los codones de parada ámbar podría causar un incremento en fracciones de proteínas truncadas, que puede ser potencialmente tóxicas o interfieren con la función de la proteína diana de longitud completa.
  • Segunda traducción, eficiente de NCAA en diversas proteínas de membrana en células de mamífero es todavía una tarea difícil, no sólo debido a la ineficiencia de los pares “O”, sino también debido a los rendimientos bajos de proteína en sistemas en los que éstos no son altamente expresado.
  • En tercer lugar, el tipo de NCAA usado es siempre dictada por el problema biológico a estudiar.
  • Finalmente, para estudios biológicos que requieren imágenes de proteínas y la espectroscopia, la incorporación de NCAA con asas químicas bio-ortogonales y sondas biofísicas es la primera opción .



Por lo tanto, a pesar del éxito actual, esto es sólo el comienzo de un campo emergente que requiere química compatible con los sistemas biológicos. Todavía hay mucho margen de mejora, sobre todo cuando las proteínas de membrana como los receptores tienen que ser examinados o modificados específicamente las proteínas intracelulares.